Western Blot이란 무엇인가?

안녕하세요, 티엄마의 생의학 일지에 오신 것을 환영합니다! 오늘은 단백질 분석에 중요한 기술인 Western Blot에 대해 알아보겠습니다. 이 기술은 생물학 및 의학 연구에서 단백질의 존재를 확인하고, 그 양을 측정하는 데 널리 사용됩니다.

Western Blot의 정의

Western Blot은 단백질을 검출하고 분석하는 실험 기법입니다. 이 기술은 단백질 샘플을 전기영동으로 분리하고, 특정 항체를 사용하여 목표 단백질을 검출하는 과정으로 이루어집니다. 이는 단백질 연구에서 매우 유용한 도구로, 특정 단백질의 존재 여부를 확인하고, 그 발현 수준을 측정하는 데 사용됩니다.

Western Blot의 원리와 과정

1. 단백질 추출
   • 샘플 준비: 세포나 조직에서 단백질을 추출합니다. 이 과정에서는 세포를 파쇄하고, 단백질을 추출하기 위해 다양한 용액과 기기를 사용합니다. 세포를 파쇄하는 방법으로는 물리적 방법(초음파 처리, 비드 비터 등)과 화학적 방법(세포 용해제 사용)이 있습니다.
   • 단백질 정량화: 추출된 단백질의 농도를 측정하여 실험에 사용할 적절한 양을 결정합니다. 일반적으로 BCA Assay, Bradford Assay 등의 방법을 사용하여 단백질 농도를 측정합니다.
2. 전기영동 (Electrophoresis)
   • SDS-PAGE: 단백질을 크기별로 분리하기 위해 SDS-PAGE(폴리아크릴아마이드 겔 전기영동)를 사용합니다. SDS는 단백질을 변성시키고 음전하를 부여하여, 전기장을 걸어주면 단백질이 크기별로 분리됩니다. 겔은 주로 10-15%의 아크릴아마이드 농도로 준비됩니다.
   • Loading and Running: 단백질 샘플을 로딩한 후, 전기장을 걸어 단백질을 분리합니다. 일반적으로 100-150V의 전압을 걸어 1-2시간 동안 진행합니다.
3. 단백질 전이 (Transfer)
   • 멤브레인 전이: 분리된 단백질을 폴리아크릴아마이드 겔에서 PVDF(Polyvinylidene difluoride)나 니트로셀룰로스 멤브레인으로 전이시킵니다. 이 과정은 전기적 방법(반전기 전이) 또는 반투과압 전이(캐프일러리 전이)로 이루어지며, 단백질이 멤브레인에 부착됩니다. 전기 전이는 일반적으로 100V로 1시간 또는 4°C에서 낮은 전압(20V)으로 오버나이트로 진행됩니다.
4. 블로킹 (Blocking)
   • 비특이적 결합 방지: 멤브레인을 비특이적 결합을 방지하기 위해 블로킹 용액(일반적으로 BSA 또는 탈지분유)을 사용하여 처리합니다. 블로킹 과정은 실온에서 1시간 또는 4°C에서 오버나이트로 진행될 수 있습니다.
5. 항체 반응 (Antibody Incubation)
   • 1차 항체: 목표 단백질에 대한 1차 항체를 사용하여 멤브레인을 처리합니다. 1차 항체는 특정 단백질에 결합합니다. 일반적으로 1차 항체는 희석액(1:500에서 1:1000)으로 희석하여 사용하며, 멤브레인은 4°C에서 오버나이트로 처리합니다.
   • 세척: 1차 항체와 반응 후, PBS-T(Phosphate Buffered Saline-Tween) 또는 TBS-T(Tris Buffered Saline-Tween)로 멤브레인을 여러 번 세척하여 비특이적 결합을 제거합니다.
   • 2차 항체: 1차 항체에 결합하는 2차 항체를 사용합니다. 2차 항체는 효소(예: HRP)나 형광 물질로 표지되어 있어, 단백질의 검출을 가능하게 합니다. 2차 항체는 일반적으로 1:1000에서 1:2000으로 희석하여 사용하며, 실온에서 1시간 동안 반응시킵니다.
6. 검출 (Detection)
   • 신호 검출: 효소 표지된 2차 항체의 경우, 기질(예: ECL, Enhanced Chemiluminescence)을 추가하여 빛을 발생시키고, 이를 X-선 필름이나 디지털 이미징 시스템으로 검출합니다. 형광 표지된 항체의 경우, 형광 신호를 검출 장비로 확인합니다. 빛의 강도는 단백질 양에 비례합니다.
7. 결과 분석
   • 밴드 확인: 멤브레인 상에 나타난 밴드를 확인하여, 목표 단백질의 존재 여부와 그 양을 분석합니다. 밴드의 크기와 강도를 비교하여, 상대적인 단백질 발현 수준을 측정할 수 있습니다. 이미징 소프트웨어를 사용하여 밴드의 밀도를 정량화할 수 있습니다.

 

Western Blot의 응용

Western Blot은 생물학 및 의학 연구에서 광범위하게 사용됩니다. 주요 응용 분야는 다음과 같습니다:

• 질병 진단: 특정 단백질 마커를 검출하여 질병을 진단할 수 있습니다. 예를 들어, HIV 진단에서 p24 단백질을 검출합니다.
• 단백질 발현 연구: 다양한 조건에서 단백질 발현 수준을 비교하여 연구합니다. 예를 들어, 세포가 특정 자극에 반응하여 단백질 발현이 어떻게 변하는지 연구합니다.
• 단백질 변형 분석: 단백질의 변형(예: 인산화)을 확인하여 신호 전달 경로를 연구합니다. 특정 단백질의 인산화 상태를 비교하여 세포 신호 전달 과정을 이해할 수 있습니다.
• 백신 개발: 항원 단백질을 확인하고 분석하여 백신 개발에 사용합니다. 백신의 효과를 평가하기 위해 항체 반응을 분석할 수 있습니다.

참고 문헌

1. Towbin, H., Staehelin, T., & Gordon, J. (1979). Electrophoretic transfer of proteins from polyacrylamide gels to nitrocellulose sheets: procedure and some applications. Proceedings of the National Academy of Sciences, 76(9), 4350-4354. DOI: 10.1073/pnas.76.9.4350
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3. Kurien, B. T., & Scofield, R. H. (2006). Western blotting. Methods, 38(4), 283-293. DOI: 10.1016/j.ymeth.2005.11.007